實(shí)驗(yàn)方法原理

?

神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng)是盡量創(chuàng)造最適合于各類神經(jīng)細(xì)胞生長的體外環(huán)境，獲得狀態(tài)良好，純度較高細(xì)胞的方法。腦部組織來源的各種神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)具有相似的取材過程和部分通用的培養(yǎng)條件。

?

實(shí)驗(yàn)材料

?

動(dòng)物組織?

?

試劑、試劑盒

?

消化液(0.25%胰蛋白酶+0.04%的EDTA)

完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清＋雙抗）

D-PBS液?

多聚賴氨酸（包被濃度100μg/ml)?

滅菌超純水

75%酒精?

?

實(shí)驗(yàn)步驟

?

除動(dòng)物消毒以外，其他步驟都在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行 。

?

1. 動(dòng)物的消毒：根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的類型和要求不同，常用胎鼠和新生鼠做神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)。消毒方法分別如下 。

?

(1) 孕鼠操作 孕鼠經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉后，以棉球蘸碘伏擦拭腹部毛皮消毒 。 擦拭從中心向外方向進(jìn)行，可更換棉球 1- 2次，面積盡量大一些，包括整個(gè)腹部和外生殖器周圍 。 用第 1 套解剖器械打開動(dòng)物腹腔，換第 2 套器械分離子宮并置于含冷 D PBS 的 100mm 玻璃皿中，再換第 3 套器械在每只胎鼠的間隔處剪開子宮并剝離出胎鼠 。

?

(2) 仔鼠操作 仔鼠（新生 7d 以內(nèi)）直接浸泡于冰的 75%酒精中， -20℃冰箱低溫消毒 10min 左右，動(dòng)物失去知覺即可開始取材 。

?

2. 皮層組織的分離：新生鼠使用眼科剪將動(dòng)物斷頭，并用鑷子剝除頭部的皮膚 。在冰 D -PBS 液中沿顱骨人字縫從后向前剝離 。 一般左手持彎鑷，在動(dòng)物兩眼處以適當(dāng)力度固定； 右手持直鑷，完成剝除皮膚 、 骨骼以及分離組織等工作 。 在顯微鏡下利用精細(xì)器械分離皮層或海馬時(shí)，沿皮層邊緣以 45° 角小心劃開，并逐步使之剝離，轉(zhuǎn)移組織入盛有冰 D - PBS 液的 35mm 小皿中；然后用精細(xì)器械仔細(xì)去除每個(gè)皮層或海馬的腦膜（整個(gè)過程需要在低溫冰袋上完成） 。

?

3.組織的分散；用管口較粗的彎頭滴管吸去帶有腦膜的 D - PBS, 盡最去除干凈液體并避免吸走組織；用虹膜剪將組織逐撮均勻剪成乳糜狀，使組織塊為 1mm³?的大小為宜 。 加入合適體積的消化液（一般蓋過組織塊并且可以隨意搖晃即可），并均勻分散組織，放入37°C 孵育箱中消化約 15min (每間隔 3 -5min 用手輕輕搖晃1次，動(dòng)物胎齡越小，越容易分散，消化時(shí)間可相應(yīng)縮短） 。

?

4. 單細(xì)胞懸液的制備!用口徑較粗的彎頭滴管將消化好的組織吸入含 3 - 5ml 冰的完全培養(yǎng)基的 10ml 離心管中，靜置 5min 左右 。 用同樣的滴管將沉底的組織轉(zhuǎn)移到另 一個(gè)含約 5ml 冰的完全培養(yǎng)基的 10ml 離心管中，并開始吹打 。 吹打時(shí)每次不超過 15 次，先用粗口徑的彎頭滴管吹散，靜置片刻后將上清用細(xì)口徑彎頭滴管轉(zhuǎn)移至另 一個(gè)離心管中，并再吹打 15 次左右 。 在原先含沉淀的離心管中再加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)吹打，并收集上清重復(fù)上述過程 。 反復(fù)吹打幾次后，組織塊基本消失，將全部上清過 200 目篩網(wǎng)以去除剩余組織塊并收集、計(jì)數(shù) 。 離心 (900r/min, 5min) 去除細(xì)胞碎片并將細(xì)胞重懸至合適的體積，以備后用 。

?

來源：《神經(jīng)生物學(xué)實(shí)用實(shí)驗(yàn)技術(shù)》第四軍醫(yī)大學(xué)出版社

?