為什么要進行封閉?

在免疫測定中必須封閉自由表面。這對于很多方法如ELISA、protein arrays、immuno-PCR、Western blotting 或免疫組織化學都是正確的做法。

ELISA板或Western blotting膜的表面經過優(yōu)化后，可有效地附著蛋白質或抗體。這樣可以在表面以高密度的捕獲抗體或捕獲分子進行最佳分析。

這種優(yōu)化的結果是，許多其他的蛋白或多肽都能附著在表面上。這種附著是可逆的。在不封閉表面的情況下，樣本中的分析抗體、示蹤劑、分析物或其他成分都會結合到表面上。這可能會導致錯誤的結果或高背景信號。即使不存在分析物，檢測抗體直接連接到ELISA板孔也會產生信號。必須阻止這種情況發(fā)生。為了使各個表面的自由結合能力飽和，必須進行封閉。通過用致密的分子層覆蓋表面而使該層沒有間隙，從而實現(xiàn)飽和。

怎樣進行封閉?

用捕獲抗體（或抗原）包被ELISA 板后，必須封閉表面的自由結合位點。 封閉溶液中含有高濃度的封閉劑。在微孔中進行孵育。這導致封閉劑吸附到表面上的自由結合位點。 理想地，產生完全致密且無間隙的層。 孵育時間取決于封閉劑，并且可能非常短（如果使用非常好的封閉劑）。 通常，建議使用更長的孵育時間并選擇適當?shù)牟僮鞑襟E。 孵化時間通常為1-2小時或過夜。

封閉后可繼續(xù)進行后續(xù)測定。除了封閉步驟外，建議隨后使用Liquid Plate Sealer® 進行封閉后板的穩(wěn)定。這可以提高捕獲抗體與分析物的結合能力，并且可以在靈敏度和可重復性方面改善某些測定的結果。 此外，可以將未使用的包被ELISA板保存更長的時間。該穩(wěn)定劑與封閉劑一起在ELISA板的孔中孵育。Liquid Plate Sealer®用易于溶解的保護層覆蓋捕獲的抗體或包被的抗原。

該層有兩個作用。首先，該層可以直接改善許多捕獲抗體或抗原的結構構象。構象的改善發(fā)生在孵育以及后續(xù)的ELISA板的干燥過程中。與未處理的捕獲抗體相比，此時的捕獲抗體具有更高的結合能力。當ELISA板干燥后，該效應與包被的捕獲分子有關，可以直接測量該效應。第二個作用是包被生物分子的長期穩(wěn)定。穩(wěn)定后，ELISA 板可在4°C下長時間保存。在大多數(shù)情況下，可以通過涂覆和存儲許多板來簡化實驗室的操作程序。穩(wěn)定化也可用于降低ELISA變異的效率。 Liquid Plate Sealer®的積極作用在很大程度上取決于所使用的生物材料（如抗體和抗原）。因此，通常不能基于單獨的測定來定量陽性效果。

存在最完美的封閉劑嗎?

沒有完美的封閉劑可以適用于各種測定。封閉劑必須與相應的檢測方法匹配，并且必須針對任何新的檢測方法進行單獨選擇。對于優(yōu)化的用于蛋白質或多肽結合的板和western blotting膜，基于蛋白質的封閉劑比其他封閉劑更有效。在大多數(shù)情況下，合成封閉劑的效率要比基于蛋白質或多肽的封閉劑低。

經典選擇: 用BSA進行封閉

BSA-Block是基于BSA（牛血清白蛋白）的經典封閉劑。 BSA是最重要的蛋白質之一，可以以良好的純度和適量的量用于研究應用。因此，它很早就被用作免疫測定中的封閉劑。它在使用過的許多測定方法中都有可靠的驗證記錄。產品BSA-Block是在經過認證的公司從純化的BSA生產出來的。與所有基于BSA的溶液一樣，封閉效果也不是最佳的。 BSA是一種蛋白質，它太大了，無法建立具有最佳密度的層。但是對于大多數(shù)測定來說，這是可以接受的，對于某些測定，BSA是最佳的封閉劑。有些抗體只有在BSA 存在時才顯示最佳結合效率。某些抗體，作為包被抗體進行包被，之后用BSA封閉后可顯示最佳結果。對于某些抗體，BSA-Block將顯示出比任何其他封閉劑更好的測定結果，因為對捕獲抗體具有直接的積極作用。結合隨后使用Liquid Plate Sealer®作為包被抗體的穩(wěn)定劑進行孵育，可以顯著改善BSA對抗體的積極作用。與合成封閉劑相比，BSA的封閉效果極佳，但低于新型封閉的效果。

最高性價比的封閉劑

許多檢測方法的開發(fā)是為了獲得良好的產品性能、可重復性和經濟性。對于此類檢測，CANDOR已開發(fā)出基于肽的封閉劑SmartBlock™。其批間一致性與合成封閉劑的高一致性相當。SmartBlock™作為一種基于肽的封閉劑，可以在表面上很好地結合，也可以結合抗體或蛋白質。 另外，肽的化學優(yōu)化增強了蛋白質結合表面上的結合。 因此，與許多其他封閉劑相比，其封閉效果更佳。盡管如此，它還是一款經濟型產品，也可以用于Western blotting和ELISA試劑盒的生產。 對于免疫研究測定和應用，SmartBlock™是最高效的封閉劑。

最有效的封閉劑

多年來，酪蛋白在文獻中已被描述為一種合適的封閉蛋白。酪蛋白的封閉效率通常優(yōu)于BSA。酪蛋白提供了許多可商購的封閉劑。在生產過程中，通常會溶解并過濾酪蛋白以去除未溶解的成分。 CANDOR提供基于酪蛋白的封閉劑——The Blocking Solution。但是， 該封閉劑無法與其他廠家提供的常規(guī)酪蛋白封閉劑相提并論。高度純化的酪蛋白在CANDOR開發(fā)的專有生產工藝中進行了化學修飾。在生產過程中，修飾的酪蛋白被片段化。結果是得到了一種光譜范圍廣泛且一致的不同大小片段的經修飾的酪蛋白溶液。盡管生產過程很困難，但批間一致性仍然非常好。每批The Blocking Solution在測定中都提供了相同的結果。從而被允許在GLP實驗室或生產具有極低檢測限的現(xiàn)代診斷中常規(guī)使用， 如現(xiàn)代生物標志物的診斷。獨特的生產工藝帶來極為有效的特色封閉劑。

與替代封閉劑如BSA相比，這款試劑極高的封閉效果可通過測量變異系數(shù)（cv）來輕松量化。通常，并非每種測定中都需要The Blocking S olution的極高功效。我們建議將The Blockin g Solution用于需要精確、可靠和可重現(xiàn)分析物定量分析的關鍵應用中，以及用于稀有和珍貴樣本的分析。

哪種類型的封閉劑是不建議使用的?

我們建議您不要使用批次與批次之間成分差異很大或可能被污染的封閉劑。使用此類封閉劑，您可以觀察到變化的結果或取決于批次的不同背景。此類封閉劑的使用不適用于GLP實驗室等規(guī)范區(qū)域或人診斷試劑盒的生產。在這些區(qū)域中，不允許更改純度， 這將意味著需要對每批產品進行廣泛的驗證。

這些不當?shù)姆忾]劑包括基于奶粉的封閉劑和一些可商購的阻滯劑，例如基于魚提取物和許多其他基于動物的提取物。 對于奶粉，應該提到的是，奶粉僅是食物，而不是用于實驗室的化學藥品。 奶粉可能是最便宜的封閉劑，但僅在污染引起的可變或不清楚的結果不是很關鍵的情況下才應使用。奶粉作為一種便宜的封閉劑應合理應用，在某些研究領域中用于測定，也可用于如大學里的教學實驗用途。

為了獲得可靠的結果，應避免使用奶粉或未純化的封閉提取物。 如果材料的來源是標準化來源，并且采用標準化的生產和純化方法，則基于魚（或其他動物）提取物的封閉劑可能是合適的。 但這是理論上的觀點，因為大多數(shù)供應商不保證標準化的來源、 純化過程和良好的批間一致性。 因此很難在市場上找到這種封閉劑。

總之，有必要為每種檢測方法尋找并找到合適的封閉劑。 在選擇合適的封閉劑之前，必須明確測定質量或結果質量的重要性。 如果是珍貴的樣本或需要可靠的結果（例如法規(guī)要求），則必須注意高封閉效率。 如果對結果質量的要求較低，也可以使用簡單的封閉劑。如大學或高校里的教學和培訓的分析，用奶粉處理則沒有任何問題。